Ферменты играют ключевую роль в метаболизме. Они ускоряют реакции, увеличивая их константы скоростей.

Рассмотрим энергетический профиль обычной реакции (рис. 12.I), проходящей в растворе по механизму столкновений А + В -> Р.

Образование продукта Р происходит, если энергия сталкивающихся молекул исходных веществ А и В превышает величину энергетического барьера. Очевидно, что можно ускорить эту реакцию, если каким-то образом уменьшить энергию активации &.Е ЗКГ

Общая схема ферментативной реакции, включает, как известно, образование единого фермент-субстратного комплекса, в активном центре которого и происходит разрыв старых и образование новых связей с появлением продукта.

В различных теоретических моделях механизма действия ферментов предлагаются разные способы понижения барьера реакции в фермент-субстратном комплексе. В результате фиксации субстрата на ферменте происходит некоторое снижение энтропии реагентов по сравнению с их свободным состоянием. Само по себе это облегчает дальнейшие химические взаимодействия между активными группами в фермент-субстратном комплексе, которые должны быть взаимно строго ориентированы. Предполагается также, что избыток энергии сорбции, который выделяется при связывании субстрата,

Рис. 12.1.

не переходит полностью в тепло. Энергия сорбции может быть частично запасена в белковой части фермента, а затем сконцентрироваться на атакуемой связи в области образовавшихся фермент-субстратных контактов.

Таким образом, постулируется, что энергия сорбции идет на создание низкоэнтропийной энергетически напряженной конформации в фермент-субстратном комплексе и тем самым способствует ускорению реакции. Однако экспериментальные попытки обнаружить упругие деформации, которые могли бы храниться в белковом глобуле фермента, не диссипируя в тепло в течение достаточно длительного времени между каталитическими актами (10 10 -3 с), не увенчались успехом. Более того, необходимая для

катализа взаимная ориентация и сближение расщепляемой связи субстрата и активных групп в центре фермента происходят спонтанно, вследствие внутримолекулярной подвижности разных, в том числе и активных, групп фермента и субстрата. Такое сближение не требует образования каких-либо энергетически неблагоприятных контактов. Этот вывод следует из анализа невалентных взаимодействий в активных центрах ряда ферментов (а-химотрипсин, лизоцим, рибонуклеаза, карбоксинептидаза). Таким образом, сама по себе напряженность конформации в фермент-субстратном комплексе не является необходимым источником энергии и движущей силой катализа.

В других моделях высказывается предположение о том, что в белковой глобуле происходит бездиссипативная передача энергии тепловых колебаний от наружных слоев белка к атакуемой связи в активном центре. Однако никаких серьезных доказательств этому нет, кроме утверждения о том, что фермент должен быть «устроен» так, чтобы его структура обеспечивала когерентный характер распространения флуктуационных изменений конформации без тепловых потерь по определенным степеням свободы.

Помимо отсутствия экспериментальных доказательств общим недостатком этих моделей является то, что в них не учитывается в явном виде важный фактор - спонтанная внутримолекулярная подвижность белка.

Шаг вперед в этом отношении сделан в конформационно-ре- лаксапионной концепции ферментативного катализа. В ней появление продукта рассматривается как результат последовательных конформационных изменений в фермент-субстратном комплексе, индуцированных первоначальными изменениями электронного состояния в активном центре фермента. Вначале, в течение короткого времени (10 |2 - 10 13 с), происходят электронно-колебательные взаимодействия, затрагивающие только выделенные химические связи субстрата и функциональные группы фермента, но не остальную часть белковой глобулы.

Вследствие этого создается конформационно-неравновесное состояние, которое релаксирует к новому равновесию с образованием продукта. Процесс релаксации происходит медленно и носит направленный характер, включая стадии отщепления продукта и релаксации свободной молекулы фермента к исходному равновесному состоянию. Координата ферментативной реакции совпадает с координатой конформационной релаксации. Температура же влияет на конформационную подвижность, а не на число активных соударений свободных молекул реагентов, что просто не имеет места в уже сформированном фермент-субстратном комплексе.

Вследствие больших различий в скоростях можно рассматривать отдельно быстрые электронные взаимодействия в активном центре, осуществляющиеся на коротких расстояниях, и более медленные конформационно-динамические изменения в белковой части.

На первом этапе катализа стохастический характер динамики белковой глобулы фермента и диффузии субстрата к активному центру приводят к образованию строго определенной конфигурации, включающей функциональные группы фермента и химические связи субстрата. Например, в случае гидролиза пептидной связи для реакции необходима одновременная атака субстрата двумя группами активного центра - нуклеофильной и электрофильной.

Пример 12.1. На рис. 12.2 приведено взаимное расположение расщепляемой пептидной связи субстрата и боковых цепей сер- 195, гис-51. Атом остатка сер-195 находится на расстоянии 2,8 А против карбонильного углерода С 1 , а протон гидроксильной группы, не нарушая водородной связи с атомом N гис-51 , располагается на расстоянии 2,0 А над атомом азота расщепляемой группы. При возникновении такой и только такой конфигурации происходит химический акт катализа. Формально это соответствует одновременному соударению нескольких молекул, что в растворе крайне маловероятно.

Возникает вопрос: какова вероятность спонтанного формирования такого рода реакционноспособной конфигурации в плотно структурированной среде за счет конформационных флуктуаций нескольких групп, происходящих по законам ограниченной диффузии?

Расчеты показывают, что существует вполне определенная вероятность одновременного попадания нескольких групп в «реакционную»

Рис. 12.2.

область некоторого радиуса, где они оказываются сближенными на короткие расстояния. Эта вероятность зависит главным образом от коэффициента диффузии и числа степеней свободы функциональных групп, «ищущих» друг друга в ограниченном пространстве. Например, при гидролизе пептидной связи необходимо создать благоприятную ориентацию для двух групп активного центра относительно определенных участков субстрата. Каждая из групп обладает тремя степенями свободы, а с учетом вибраций молекулы субстрата общее число степеней свободы N - 6 - 7. Это типично для ферментативных процессов.

Оказывается, что в обычных условиях среднее время образования такой активной конфигурации составляет т ~

10 2 - 1СИс, что совпадает с временами оборота фермента в условиях субстратного насыщения. В растворе для аналогичной реакции это время намного больше даже при значительных коэффициентах диффузии. Причина состоит в том, что, попав в ограниченную область в плотно структурированной среде, функциональные группы «находят» друг друга и сближаются на короткие расстояния раньше, чем они «разбегутся» в разные стороны, как это происходит в растворе. Вместе с тем величина т - 10~ 2 - 1СНс намного больше, чем времена релаксаций отдельных групп, что является следствием достаточно жестких стерических условий для протекания реакции. Увеличение числа функциональных групп и необходимых одновременных контактов между ними приводит к увеличению времени достижения многоцентровой активной конфигурации. Общая скорость ферментативного катализа определяется именно временем образования нужной конформации при спонтанном сближении соответствующих групп в активном центре. Следующие за этим электронные взаимодействия происходят гораздо быстрее и не лимитируют общую скорость катализа.

Существует ряд особенностей ферментов, облегчающих превращение субстрата в активном центре. Как правило, микросреда активного центра с его аминокислотными остатками более гидро- фобна, чем окружающая водная среда. Это снижает значение диэлектрической постоянной активного центра (е

Высокая локальная концентрация диполей пептидных связей создает в активном центре электрические поля напряженностью порядка тысяч и сотен тысяч вольт на сантиметр. Таким образом, ориентированные полярные группы создают внутриглобулярное электрическое поле, влияющее на кулоновские взаимодействия в активном центре.

Механизмы самих электронных переходов в активной конфигурации требуют для своей расшифровки привлечения методов квантовой химии. Перекрывание электронных орбиталей может привести к перераспределению электронной плотности, появлению дополнительного заряда на разрыхляющей орбитали атакуемой связи в субстрате и ее ослаблению.

Именно это и происходит при гидролизе пептидной связи в тетраэдрическом комплексе (см. рис. 12.2). Стекание электронной плотности от Ofoj-cep-195 на разрыхляющую орбиталь в пептидной связи происходит за счет взаимодействия неподеленной пары электронов 0[ 95 5 с я-электронами атома С 1 пептидной связи. При этом нело- деленная пара азота аминной группы выталкивается из пептидной

Рис. 12.3.

связи N=C", которая утрачивает двойной характер и в результате ослабляется.

Одновременно отекание электронной плотности от 0,95 ослабляет и связь Н-О^. Но тогда облегчается взаимодействие Н фермента и N аминной группы и ее протонирование с переходом протона от 0"[ ч5 к гис-57. В свою очередь это опять увеличивает взаимодействие Oj9 5 c пептидной группой и т.д.

Таким образом, в тетраэдическом комплексе создается уникальная ситуация, когда несколько мономолекулярных реакций протекают одновременно, взаимно ускоряя друг друга. Синхронное перемещение заряда и протона между сер- 195, гис-57, пептидной связью обеспечивает высокую эффективность процесса. Каталитический акт сводит в единую кооперативную систему три отдельные бимолекулярные реакции, ведущие к разрыву пептидной связи - событию, маловероятному в растворе. В системе индицируются естественные конформационные перестройки и в итоге происходит деацилирова- ние фермента и протонирование атома 0} 95 .

Принцип образования полифункциональной замкнутой системы атомных групп в активной конфигурации выполняется и в других фермент-субстратных комплексах (рис. 12.3).

В ферментативном катализе многостадийный характер превращений субстрата, маловероятный в растворе, обеспечивается за счет синхронного кооперативного их протекания в единой полифункцио- нальной системе.

Замена малоэффективных последовательных активационных стадий скоординированным процессом приводит формально к снижению энергии активации всей реакции. Заметим еще раз, что, строго говоря, физический смысл понятия «энергия активации» в ферментативных процессах не соответствует таковому для реакций в растворах, идущих по механизму активных столкновений свободных молекул.

Катализаторы - вещества, изменяющие скорость химической реакции, но сами при этом остающиеся без изменений. Биологиче­ские катализаторы называются ферментами.

Ферменты (энзимы) - биологические катализаторы белковой природы, синтезируемые в клетках и ускоряющие химические ре­акции при обычных условиях организма в сотни и тысячи раз.

Субстрат - вещество, на которое действует фермент.

Апофермент - белковая часть молекулы фермента-протеида.

Коферменты (кофакторы) - небелковая часть фермента, иг­рает важную роль в каталитической функции ферментов. В их со­став могут входить витамины, нуклеотиды и др.

Активный центр фермента - участок молекулы фермента, обладающий специфической структурой, который связывает и преобразует субстрат. В молекулах простых белков-ферментов (протеинов) построен из остатков аминокислот и может включать различные функциональные группы (-СООН, -NH 2 , -SH, -ОН и др.). В молекулах сложных ферментов (протеидов) помимо аминокислот в образовании активного центра участвуют вещества небелковой природы (вита­мины, ионы металлов и др.).

Аллостерический центр фермента - участок молекулы фер­мента, с которым могут связываться специфические вещества, из­меняя структуру фермента и его активность.

Активаторы ферментов - молекулы или ионы, повышающие активность ферментов. Например, соляная кислота - активатор фермента пепсина; ионы кальция Са ++ являются активаторами АТФ-азы мышц.

Ингибиторы ферментов - молекулы или ионы, снижающие активность ферментов. Например, ионы Hg ++ , Pb ++ угнетают ак­тивность почти всех ферментов.

Энергия активации - дополнительное количество энергии, которой должны обладать молекулы для того, чтобы их столкно­вение привело к взаимодействию и образованию нового вещества.

Механизм действия ферментов - обусловлен способностью ферментов понижать энергетический барьер реакции за счет взаимодействия с субстратом и образования промежуточного фермент-субстратного комплекса. Для осуществления реакции с участием фермента требуется меньше энергии, чем без него.

Термолабильность ферментов – зависимость активности ферментов от температуры.

Температурный оптимум ферментов - интервал температур от 37° до 40°С, при котором наблюдается наибольшая активность ферментов в организме человека.

Специфичность ферментов - способность фермента катализировать определенную химическую реакцию.

Относительная специфичность фермента - способность катализировать превращения группы субстратов сходного строения, имеющих определенный тип связи. Например, фермент пепсин катализирует гидролиз различ­ных пищевых белков, осуществляя разрыв пептидной связи.

Абсолютная (строгая) специфичность фермента - способ­ность катализировать превращения только одного субстрата опре­деленной структуры. Например, фермент мальтаза катализирует гидролиз только мальтозы.

Профермент - неактивная форма фермента. Например, про­ферментом пепсина является пепсиноген.

Кофермент А, или коэнзим ацетилирования (КоА) - кофермент многих ферментов, которые катализируют реакции присое­динения ацетильных групп к другим молекулам. В его состав вхо­дит витамин В 3 .

НАД (никотинамидадениндинуклеотид) - кофермент фер­ментов биологического окисления, переносчик атомов водорода. В его состав входит витамин РР (никотинамид).

Флавинадениндинуклеотид (ФАД) - небелковая часть флавинзависимых дегидрогеназ, которая связана с белковой частью фермента. Участвует в окислительно-восстановительных реакциях, содержит витамин В 2 .

Классы ферментов:

Оксидоредуктазы - ферменты, катализирующие окислитель­но-восстановительные реакции. К ним относятся дегидрогеназы и оксидазы.

Трансферазы - ферменты, катализирующие реакции переноса атомов или групп атомов от одного вещества к другому.

Гидролазы - ферменты, катализирующие реакции гидролиза веществ.

Лиазы - ферменты, катализирующие реакции негидролитиче­ского отщепления от субстрата групп атомов или разрыв углерод­ной цепи соединения.

Изомеразы - ферменты, катализирующие реакции образова­ния изомеров веществ.

Лигазы (синтетазы) - ферменты, катализирующие реакции биосинтеза различных веществ в организме.

В ферментативной реакции можно выделить следующие этапы:

1. Присоединение субстрата (S) к ферменту (E) с образованием фермент-субстратного комплекса (E-S).
2. Преобразование фермент-субстратного комплекса в один или несколько переходных комплексов (E-X) за одну или несколько стадий.
3. Превращение переходного комплекса в комплекс фермент-продукт (E-P).
4. Отделение конечных продуктов от фермента.

Механизмы катализа

1. Кислотно-основной катализ – в активном центре фермента находятся группы специфичных аминокислотных остатков, которые являются хорошими донорами или акцепторами протонов. Такие группы представляют собой мощные катализаторы многих органических реакций.

2. Ковалентный катализ – ферменты реагируют со своими субстратами, образуя при помощи ковалентных связей очень нестабильные фермент-субстратные комплексы, из которых в ходе внутримолекулярных перестроек образуются продукты реакции.

Типы ферментативных реакций

1. Тип "пинг-понг" – фермент сначала взаимодействует с субстратом А, отбирая у него какие либо химические группы и превращая в соответствующий продукт. Затем к ферменту присоединяется субстрат В, получающий эти химические группы. Примером являются реакции переноса аминогрупп от аминокислот на кетокислоты - трансаминирование .

Ферментативная реакция по типу "пинг-понг"

2. Тип последовательных реакций – к ферменту последовательно присоединяются субстраты А и В, образуя "тройной комплекс", после чего осуществляется катализ. Продукты реакции также последовательно отщепляются от фермента.

Ферментативная реакция по типу "последовательных реакций"

3. Тип случайных взаимодействий – субстраты А и В присоединяются к ферменту в любом порядке, неупорядоченно, и после катализа так же отщепляются.

Для протекания любой реакции необходимо, чтобы реагирующие молекулы пришли в контакт друг с другом. Однако не каждое столкновение молекул сопровождается их взаимодействием, реакция протекает только в том случае, если молекулы обладают достаточным запасом кинетической энергии. Совокупность молекул любого вещества представляет собой статистический набор молекул с различной кинетической энергией. Энергию, необходимую для достижения активированного (переходного) состояния, или тот избыток энергии по сравнению со средней энергией молекул при данной температуре, которым они должны обладать, чтобы вступить в реакцию, называют энергией активации (Еа). В случае ферментативных реакций энергетический барьер снижается благодаря образованию ферментсубстратного комплекса, а чем меньше энергия активации, тем быстрее протекают реакции, так как вступить во взаимодействие могут молекулы с меньшим запасом энергии.

при ферментативной и неферментативной реакциях для достижения переходного состояния молекулы исходных веществ активируются, приобретают более высокий запас энергии, только после этого они могут претерпевать превращение в продукты реакции, но (Еа) в случае ферментативной реакции ниже.

Таким образом, большие скорости ферментативных реакций являются в конечном счете результатом снижения энергии активации катализируемых реакций. Именно благодаря тому, что биологические катализаторы снижают энергию активации, ферментативные реакции протекают с высокой скоростью при относительно низкой температуре.

Снижение энергии активации при ферментативном катализе имеет некоторую связь с многостадийностью этих реакций. Они протекают не в один этап, а ступенчато, через несколько промежуточных реакций. Активационный барьер реакции при этом разбивается на несколько более низких барьеров каждой промежуточной реакции, преодолеть которые реагирующим молекулам легче, чем один большой барьер.

Ферментативный катализ имеет признаки как гомогенного, так и гетерогенного катализа, протекающего на границе раздела двух фаз. В каталитическом действии ферментов можно выделить 3 стадии: 1) присоединение молекулы субстрата (S) к ферменту (Е), 2) превращение субстрата, 3) отделение конечных продуктов реакции (Р) от фермента. Простейшая схема ферментативной реакции записывается следующим образом.

E + S ⇆ ES → E + P

Наиболее быстрой обычно является первая стадия реакции, медленной - вторая. На 1-й стадии реакции происходит образование фермент-субстратного комплекса (ЈS, ФСК), в результате чего структура и свойства молекулы субстрата меняются, образуются его переходные формы. Это является главной предпосылкой ускорения процесса его превращения в катализируемой реакции.

Образование ФСК создает предпосылки высокой каталитической активности. Установлено, что при образовании ФСК молекулы фермента и субстрата не только сближаются, но и определенным образом ориентируются друг относительно друга. Между структурой субстрата и активного центра фермента кроме стерического соответствия существует и топохимическое, при котором обеспечивается взаимодействие узнающих групп фермента (связывающая зона) и узнаваемых групп субстрата. Связывание фермента и субстрата обычно многоточечное и при этом - чем выше специфичность фермента, тем больше точек узнавания.

Немаловажным фактором, вносящим определенный вклад в возрастание скорости ферментативных реакций, является увеличение на несколько порядков времени контакта реагирующих молекул в результате многоточечного связывания субстрата (ов) ферментом. Время, в течение которого длится контакт молекул при столкновении в случае чисто химической реакции, равно приблизилотельно периоду тепловых колебаний молекул (10 13 -10 12 с). За это время не всегда успевает произойти химическая реакция.

При оптимальном связывании субстрата с ферментом образуется продуктивный ферментсубстратный комплекс, т. е. такой комплекс, который через ряд промежуточных стадий дает продукт (ы) реакции. Эти процессы протекают на 2-й стадии ферментативной реакции. Быстрому протеканию ферментативной реакции способствует то, что при взаимодействии субстрата с ферментом индуцируется напряжение разрываемых связей в субстрате (деформация или дестабилизация их), т. е. разрываемые связи становятся менее стабильными, чем в свободном субстрате.

Увеличение скорости реакции под влиянием ферментов происходит и благодаря большей гидрофобности среды активного центра по сравнению с окружающим раствором, в такой среде наблюдается десольватация заряженного субстрата, приводящая к дестабилизации разрываемой связи.

Важной особенностью ферментативных реакций является и то, что превращение субстрата протекает как полифункциональный катализ. Полифункциональность обеспечивается разнообразием аминокислотных остатков белковой части фермента и групп кофакторов в активном центре; на превращающуюся химическую связь субстрата одновременно или в результате серии последовательных атак воздействует несколько групп фермента. В результате этого происходит поляризация превращающейся связи и затем ее разрыв.

Многие группы в активных центрах ферментов функционируют как обобщенные кислоты или основания, воздействуют на субстрат, активируют его и тем самым увеличивают скорость катализа. Обобщенные кислоты, согласно Бренстеду,- это любые доноры протонов, а основания - акцепторы протонов. Особенно эффективен обобщенный кислотно-основной катализ. Он дает увеличение скорости в 10-100 раз. В качестве обобщенных кислотно-основных катализаторов функционируют в активном центре боковые радикалы таких аминокислот, как, например, глутамин, аспарган, гистидин, лизин, тирозин и др. В протонированной форме они являются кислотными катализаторами, в непротонированной - основными.

Нуклеофильные группы ферментов вступают в реакции нуклеофильного замещения, что приводит к образованию ковалентных промежуточных соединений, - ковалентный катализ. Нуклеофильная группа становится на место замещаемой группы, образуется ковалентный интермедиат; он неустойчив и легко распадается на продукты реакции. Сильным нуклеофилом является имидазольная группа гистидин, поэтому химическая модификация гистидин в составе активного центра приводит к инактивации ферментов. К нуклеофильным группам относятся также ОН-группа серин, SH-группа цистеин. Примерами электрофильных групп являются ионы металлов, например, Zn 2+

Одна из функций, которую выполняют металлы в ферментах, заключается в том, что они выступают в роли электрофильных агентов. Так, в активном центре карбоксипептидазы А, содержащем ион Zn 2+ , последний представляет собой электрофильный агент, оттягивающий электроны от пептидной связи субстрата, облегчая ее гидролиз.

3.5. Типы ферментативных реакций. Ферментативные реакции по числу участников делятся на односубстратные и двухсубстратные. С большим числом субстратов реакции встречаются достаточно редко. Самым распространенным типом ферментативной реакции является двухсубстратная реакция с образованием двух продуктов: A+B ⇆ C + D. К этому типу относится примерно 60% всех известных реакций и прежде всего реакции переноса групп.

Редко встречаются односубстратные - однопродуктные реакции, примерами их являются реакции изомеризации, в частности глюкозо-1-фосфат ⇆ глюкозо-6-фосфат. Однако многие реакции по своим свойствам близки к односубстратным. Это наблюдается в тех случаях, когда из двух субстратов варьирует концентрация только одного. Например, гидролитические реакции можно рассматривать как односубстратные, так как концентрацию 2-го субстрата - воды - можно считать постоянной, в процессе реакции она уменьшается несущественно.

Реакции с одним субстратом по существу являются мономолекулярными химическими реакциями (А-P). Большинство из них относится к реакциям 1-го порядка, поскольку скорость реакции пропорциональна концентрации только одного реагирующего вещества Порядок реакции определяется характером ее зависимости от концентрации субстрата. Скорость мономолекулярной реакции может не зависеть от концентрации субстрата (при его избытке), тогда порядок реакции будет нулевым (V=ko, где k 0 - константа скорости реакции нулевого порядка).

К реакциям 1-го порядка будут относиться и бимолекулярные (двухсубстратные) реакции. Это происходит в том случае, если концентрация одного из субстратов очень высока по сравнению с концентрацией другого, как, например, в случае реакций гидролиза. Большинство бимолекулярных реакций является реакциями 2-го порядка, поскольку их скорость пропорциональна концентрации двух реагирующих веществ или реже квадрату концентрации субстрата.

3.6. Множественные молекулярные формы ферментов и изоферменты.

Под множественными молекулярными формами ферментов (ММФФ) понимают группу ферментов, выполняющих идентичную каталитическую функцию у одного биологического вида, но отличающихся по структуре и ряду физико-химических свойств. Для разделения ММФФ наиболее часто используют различные варианты метода электрофореза с последующим специфическим выявлением зон, обладающих одинаковой ферментативной активностью. На электрофореграммах зоны активности ММФФ обозначают арабскими цифрами в порядке уменьшения анодной подвижности.

Все ММФФ делят на шесть классов.

1. Генетически независимые белки . Это ферменты, синтезирующиеся на разных генах. У многоклеточных организмов они часто характеризуются различной внутриклеточной, тканевой локализацией: например, пируваткиназа, енолаза, фруктозодифосфатальдолаза в тканях мышц и печени, малатдегидрогеназа и ряд аминотрансфераз - в митохондриях и цитозоле.

2. Гетерополимеры (гибриды) двух и более полипептидных цепей, связанных нековалентно. Примерами молекулярных форм ферментов этого класса являются ЛДГ, алкогольдегидрогеназа, креатинкиназа.

3. Генетические варианты (аллелозимы). Аллелозимы встречаются у организмов, гетерозиготных по генам, кодирующим данный фермент. В этот класс входят мутантные формы ферментов. Это очень многочисленный класс молекулярных форм ферменов, сюда относятся, например, глюкозо-6-фосфат - дегидрогеназа человека, аденозиндезаминаза и многие другие.

4. Сопряженные или производные белки . К этому классу ММФФ принадлежат формы ферментов, образующиеся в результате ковалентного присоединения или отщепления специфических групп к (от) белку. Такие модификации, как правило, сопровождаются изменениями ферментативной активности и некоторых физико-химических свойств фермента. Модификация может заключаться в фосфорилировании - дефосфорилировании (гликоген-фосфорилаза, гликоген-синтаза, фруктозо-дифосфатаза), аденилировании - деаденилировании (глутамин-синтетаза из Е. coli ), окислении сульфгидрильных групп (ксантиноксидаза, липоилдегидрогеназа), гликозилировании (варьирование числа углеводных остатков показано для β-глюкуронидазы из печени быка, глюкозооксидазы из Penicilliumvitale, ДНКазы и РНКазы из поджелудочной железы быка), амидировании остатков аспаргин и глутамин (неодинаковая степень амидирования обнаружена у щелочной протеазы из Streptomycesrectus), расщеплении пептидных связей протеазами (альдолаза).

5. Олигомеры единственной субъединицы . При наличии у фермента четвертичной структуры различные молекулярные формы могут возникать за счет объединения в четвертичную структуру разного числа одинаковых полипептидных цепей. Так, β-глюкозидаза активна в виде моно-, ди-, тетра- и октамера. Различная степень олигомерности как причина появления ММФФ была установлена для глутаматдегидрогеназы, холинэстеразы и ряда других ферментов.

6. Конформационно различающиеся формы (конфорнеры). Конформерами называют белки, отличающиеся по конформации при одной и той же аминокислотной последовательности. Различия в пространственной структуре белка, связанные с числом заряженных групп на поверхности молекулы, приводят к неодинаковой электрофоретической подвижности. К 6-му классу будут относиться и все аллостерически модифицируемые ферменты.

Итак, термин ММФФ может быть использован как наиболее общий для группы ферментов, встречающихся у одного биологического вида и обладающих одинаковой специфичностью действия. Его следует использовать независимо от причины их появления. Термин изофермент, или изоэнзим, применим только к тем ММФФ, появление которых связано с генетически детерминированными различиями в первичной структуре (классы 1-3), а не с теми, которые обусловлены другими причинами при однаковой первичной структуре (классы 4-6).